的跨膜蛋白206簡(jiǎn)稱為TMEM206是伏于遍在表達(dá)，質(zhì)子活化，外向整流的進(jìn)化上保守的氯離子通道陰離子電流。在現(xiàn)在發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》上的新報(bào)告中圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Deng Zinqin Deng和一個(gè)多學(xué)科研究小組描述了河豚TMEM206的低溫電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)形成具有兩個(gè)跨膜區(qū)段和大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的三聚體通道。根據(jù)結(jié)果??，鄧等人。展示了如何從三個(gè)側(cè)面入口側(cè)向進(jìn)入細(xì)胞外區(qū)域的充足前庭，其中三個(gè)孔包含多個(gè)結(jié)構(gòu)。例如，靠近內(nèi)螺旋的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的保守的賴氨酸殘基大概形成了氯離子選擇性過濾器。核心結(jié)構(gòu)和組裝類似于鈉通道，在氨基酸序列上不相關(guān)，因此傳導(dǎo)陽(yáng)離子而不是陰離子。

氯離子通道

氯離子是動(dòng)物中豐富的陰離子，它們通過氯離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞膜上移動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞體積調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)酸化和肌肉興奮性控制。盡管到目前為止，氯離子流背后的分子成分仍然難以捉摸，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已廣泛觀察到離子。兩項(xiàng)使用全基因組RNA干擾篩選的獨(dú)立研究已將TMEM206確定為潛在的陰離子通道。TMEM206在脊椎動(dòng)物中是進(jìn)化保守的。氯離子通道在氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)上都各不相同。在這項(xiàng)工作中，鄧等人。提出了河豚魚TMEM206的低溫電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu)揭示了與以前已知的三聚體通道結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。科學(xué)家將電生理學(xué)與這項(xiàng)工作相結(jié)合，為進(jìn)化上保守且廣泛表達(dá)的氯離子通道提供了第一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能描述，以建立分子框架并了解氯離子的傳導(dǎo)和通道門控。

研究人員使用帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的構(gòu)建體來識(shí)別TMEM206候選物，并選擇了河豚魚TMEM206，因?yàn)樗鼈兣c人類氯離子通道具有50%的共享序列同一性。鄧等。然后純化全長(zhǎng)野生型河豚TMEM206蛋白，并對(duì)其進(jìn)行單顆粒冰凍EM分析。他們使用3D重建圖揭示了具有跨膜和膜外結(jié)構(gòu)域的三聚體通道結(jié)構(gòu)。TMEM206形成了一個(gè)對(duì)稱的三聚體，其中每個(gè)亞基都包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)具有兩個(gè)名為TM1和TM2的跨膜螺旋，以及一個(gè)富含β結(jié)構(gòu)域的大細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)，該結(jié)構(gòu)域在上層和下層中還組織有其他基序。另外，廣泛的側(cè)鏈接觸通過內(nèi)部和外部β結(jié)構(gòu)域中的范德華相互作用而參與。三聚體通道組件在細(xì)胞外區(qū)域的中間引入了三個(gè)側(cè)向開口或側(cè)向入口，可能有助于離子和水的通過。細(xì)長(zhǎng)的側(cè)門延伸到ECD-TMD連接處，以恢復(fù)緊密的包裝相互作用。為了克服確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何技術(shù)難題，Deng等人。融合了骨限制干擾素誘導(dǎo)的跨膜樣蛋白的C端(BRIL的縮寫);一種四螺旋束蛋白，廣泛用作結(jié)晶伴侶，以改善膜的穩(wěn)定性并促進(jìn)晶體形成。

離子滲透途徑和誘變研究

使用孔半徑計(jì)算，鄧等。顯示了中心離子傳導(dǎo)孔如何包含多個(gè)收縮區(qū)域以防止離子通過。由于用于確定cryo-EM結(jié)構(gòu)的高pH緩沖液條件(pH 8.0)，該結(jié)構(gòu)表示非導(dǎo)電構(gòu)象。由于在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中缺乏蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸，因此可以從側(cè)面進(jìn)入龐大而細(xì)長(zhǎng)的前庭。蛋白質(zhì)通道的窄點(diǎn)不會(huì)干擾離子傳導(dǎo)，并且可以在通道門控周期中隨著離子穿過三個(gè)側(cè)面入口而得以維持。前庭和側(cè)面入口的內(nèi)壁略帶正電，也促進(jìn)了氯離子的吸引。在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-跨膜結(jié)構(gòu)域(ECD-TMD)交界處，三股線連接到外部螺旋，并向內(nèi)移動(dòng)以連接內(nèi)部螺旋，以在膽汁層上方生成細(xì)胞外門。在面向孔的位置上的連續(xù)結(jié)構(gòu)形成了疏水門，該疏水門可能會(huì)阻止離子傳導(dǎo)。

為了支持結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，鄧等人。對(duì)主要的孔活性殘基進(jìn)行了誘變研究。當(dāng)他們用丙氨酸或酸性殘基取代保守的堿性殘基時(shí)，酸活化的氯離子電流被消除。相反，精氨酸取代保留了通道功能，以進(jìn)一步支持陰離子選擇性過濾器中正電荷的需求。例如，I310域形成了跨膜門的關(guān)鍵組件，而另一種稱為K320的結(jié)構(gòu)則形成了陰離子選擇性過濾器。這項(xiàng)工作支持人類與河豚直系同源物之間的結(jié)構(gòu)保守，以代表氯離子通道的生理相關(guān)模型。

結(jié)構(gòu)趨同

TMEM206的拓?fù)洌Y(jié)構(gòu)和組裝代表了離子通道(包括酸敏感離子通道(ASIC))的上皮鈉通道(ENaC)/去氫蛋白超家族的拓?fù)?，結(jié)構(gòu)和組裝。盡管兩個(gè)通道之間缺乏獨(dú)特的氨基酸序列同源性。然而，帶相反電荷的鈉和氯離子的三聚體通道共有一個(gè)共同的核心結(jié)構(gòu)，兩側(cè)是兩個(gè)跨膜螺旋。研究小組指出，通道激活后，前庭和跨膜孔之間的細(xì)胞外門如何擴(kuò)展以使離子通過。雖然上皮鈉通道可以通過在細(xì)胞外域中通過蛋白水解釋放抑制性肽來激活，但ASIC和TMEM206只能是被細(xì)胞外質(zhì)子激活。TMEM和AS1CS之間保守的結(jié)構(gòu)特征也暗示了這兩種分子的類似門控構(gòu)象變化。

外表

這樣，Zengqin Deng及其同事就使用了單粒子冷凍EM來確定通常使用傳統(tǒng)X射線晶體學(xué)無(wú)法獲得的完整膜蛋白的結(jié)構(gòu)。由于低的對(duì)比度和信噪比，對(duì)于小尺寸的膜蛋白實(shí)現(xiàn)近原子分辨率仍然是一項(xiàng)重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。鄧等。通過融合小的結(jié)晶分子伴侶BRIL來提高通道的3.5埃分辨率結(jié)構(gòu)，從而提高了次優(yōu)膜蛋白的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了晶體堆積?；诒Ｊ氐暮私Y(jié)構(gòu)，通道對(duì)陽(yáng)離子或陰離子具有選擇性，并經(jīng)歷類似的門控構(gòu)象變化。這項(xiàng)工作建立了新的一類氯離子通道，從而為細(xì)胞和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)一步功能和機(jī)械研究形成了新的框架。